Laporan Mikroteknik : Metode Parafin

LaporanMikroteknikHewan

Hari/Tanggal                        : Rabu/12 September 2012                                               Asisten : - AgusHeryanto/ G34080117

Kelompok                             : 8                                                                                           - DesiSetianingsih/ G34080086

Nama/NIM                           : - NindyaSaputri/G34100075                                          - YennyChusna K/ G34080041

- NindyaPangestika/G34100

- SefriatinNurmaulani/G34100059

- Rastyawati/G34100070

- FiaAfianiZakky/G34100080

METODE PARAFIN

Pendahuluan

                Metode paraffin merupakan cara pembuatan preparat permanen dengan menggunakan paraffin sebagai media embedding dengan tebal irisan kurang lebih mencapai 6 µm-8 µm. Metode in imemiliki irisan yang lebih tipis dibandingkan dengan menggunakan metode beku atau metode seloidin yang tebal irisannya kurang lebih mencapai 10 µm. Prosesnya juga jauh lebih cepat dibandingkan metode seloidin. Selain itu metode parafin juga memiliki kejelekan yaitu jaringan menjadi keras, mengerut dan mudah patah, jaringan-jaringan yang besar menjadi tidak dapat dikerjakan, dan sebagian besar enzim-enzim akan larut karena menggunakan metode ini(Gunarso 1986).

Metode paraffin memiliki langkah-langkah penting dalam metode ini antara lain fiksasi, pencucian, dehidrasi, penjernihan, embedding, penyayatan (section), penempelan, pewarnaan, danpenutupan(Dasumiati 2008). Larutan fiksasi yang digunakan untuk proses fiksasi adalah larutan Bouine. Larutan fiksasi ini merupakan larutan yang mampu bereaksi dan menandai suatu sel dengan spesimen diiris setipis mungkin. Hal ini sangat mendukung laju fiksasi dalam sel(Dasumiati 2008).

 Embedding merupakan proses pelilinan suatu organ dengan menggunakan kotak kertas. Proses ini memudahkan dalam membuat irisan yang sangat tipis dengan menggunakan mikrotom. Beberapa keuntungan menggunakan kotak kertas. Dalam embedding yaitu bisa membuat arah sayatan dan menandai suatu jaringan. Jaringan atau sampel akan ditanam di ketas kotak, dengan terlebih dahulu parafin membeku pada bagian dasar dalam kotak dan setelah penempelan jaringan dilanjutkan dengan penutupan dengan parafin sampai membeku.
Proses penyayatan (sectioning) diawali dengan pengirisan blok parafin dengan scalpel, sehingga permukaan blok parafin yang akan diiris dengan mikrotom berbentuk trapesium. Letak mata pisau pada mikrotom menentukan hasil yang diperoleh. Hasil sayatan diambil dengan menggunakan kuas secara hati-hati. Pita hasil sayatan ditempel pada kaca objek dengan menggunakan meyer albumin. Kaca obyek tersebut diletakkan di atas meja penangas ( haeting plate). Meyer albumin memiliki kandungan putih telur dan gliserin dan merupakan pelakat alami yang sangat baik). Sedang proses pewarnaan dilakukan setelah preparat dideparafinasi dengan merendam preparat pada xylol. Salah satu pewarna metode parafin pada jaringan hewan adalah hematoxylin dan Eosin. Zat warna hematoxilin ini bersifat mewarnai inti sedang eosin mewarnai sitoplasmanya(ArisworoD2000).

Tujuan

                Tujuan dari percobaan ini untuk mengetahui cara membuat sediaan sayatan organ hewan dengan menggunakan metode parafin.

Metode

Blocking :

	Merendam organ dengan larutan NaCl fisiologis
	Fiksasi organ dalam FAAAC  (24 jam)

 

Mencuci organ dengan aquades

 

Dehidrasi dengan alkohol bertingkat (1jam)

 

Penjernihan di dalam xylol bertingkat  (30 menit)

 

Organ dimasukkan ke dalam parafin I-III di dalam oven 58-60⁰C

 

Pemotongan :

Pemotongan sisi-sisi parafin sehingga berbentuk prisma segitiga

 

Pemberian parafin cair di bagian bawah prisma

 

Pemotongan dengan mikroton (6 µm)

 

Pewarnaan :

Perendaman dalam xylol bertingkat (5-15 menit)

 

Perendaman dalam hematoksilin  (2 menit)

 

Masukkan ke dalam alkohol 70%, bilas dengan air kran

 

Perendaman dalam eosin (10 menit)

 

Bilas dengan air kran

 

Keringkan dengan tissue

 

Xylol bertingkat (5 menit)

 

Beri entellan (2 tetes), tutup dengan penutup objek

 

Beri nama dan tanda panah

 

Hasil Pengamatan

Gambar adrenalin mencit

Perbesaran 4 x 10

Gambarlimpamencit

Perbesaran : 4x10                                                                              

Pembahasan

                Langkah pertama yang dilakukan dalam metode paraffin adalah dengan merendam organ yang akan diblocking dengan larutanNaCl fisiologis yang berfungsi untuk mempertahankan sel dari organ tersebut agar tidak berubah bentuk sebab NaCl fisiologis merupakan larutan yang konsentrasinya sesuai dengan keadaan tubuh organ yang akandibuat blocking. Organ kemudian difiksasi dalam larutan FAAAC selama 24 jam untuk organ berukuran 1x1cm, fiksasi berguna untuk mengawetkan organ, mengeraskan jaringan yang lembek, dan juga mencegah kerusakan jaringan. Lalu organ dicuci dengan aquades beberapa kali sampai tidak berbau lagi. Setelah itu dilakukan dehidrasi dengan alcohol bertingkat mulai dari 30%, 50%, 70%, 80%, 95% dan alkohol absolut yang masing-masing didehidrasi selama 1 jam. Fungsi dehidrasi adalah menghilangkan air dalam jaringan, untuk itu bahan yang digunakan untuk dehidrasi harus mampu menggantikan fungsi air. Setelah itu organ dimasukkan ke dalam Xylol I selama 30 menit hingga organ berubah warna menjadi putih. Saat menggunakan Xylol harus berhati-hati sebab Xylol bersifat korosif. Organ kemudian direndam dalam Xylol II yang merupakan campuran dari paraffin selama 5 menit. Xylol II berfungsi sebagai penjernih. Setelah itu, organ dimasukkan ke dalam parafin I, parafin II dan parafin III yang masing-masing selama 45 menit. Selama proses penjernihan dari Xylol II hingga pembuatan block parafin III semua dilakukan di dalam oven dengan suhu 58-60⁰C, tujuannya agar paraffin tetap cair sebab paraffin memiliki titik didih yang lebih rendah di bandingkan dengan lilin umumnya sehingga lebih cepat membeku pada suhu kamar. Parafin yang telah cair lalu dituangkan ke dalam kertas block yang telah diberi tanda panah terlebih dahulu untuk membedakan antara kepala (anterior) dan badan (posterior). Parafin dituang sedikit dulu dan tunggu agar dasarnya membeku tujuannya agar organ tetap berada pada posisi tengah baru kemudian organ yang akan dibuat block ditaruh di dalam paraffin dengan menggunakan sudip yang ujungnya agak cekung ke dalam, paraffin cair dituang kembali hingga penuh. Setelah penuh  ratakan  pinggir block dengan sudip yang ujungnya rata yang telah dipanaskan terlebih dahulu lalu masukkan untuk memastikan tidak ada gelembung lagi di dalamnya namun hanya dipinggirnya saja. Usahakan pada saat pembuatan block, gelas yang digunakan terbuat dari stainless steel agar mudah di panaskan serta memiliki bibir gelas yang agak panjang agar lebih mudah pada saat penuangan parafin cair ke dalam kertas block.

                Setelah block yang dibuat mengeras langkah selanjutnya adalah pemotongan. Parafin yang sudah mengeras dipotong dengan cutter dan dibentuk trapezium dengan posisi anterior potongannya lebih kecil disbanding posisi posterior. Potongan spesimen yang sudah berbentuk trapezium diletakkan tepat ditengah holder yaitu bagian dari mikrotom untuk menyimpan paraffin dengan posisi anterior di  atas dan posterior di bawah. Holder sebelumnya telah dilapisi dengan paraffin sisa dari pemotongan lalu letakkan specimen dan rekatkan kembali dengan paraffin sisa dari pemotongan dengan cara dipanaskan di atas api lalu  diratakan dan didiamkan hingga membeku. Spesimen yang telah ditaruh di atas holder dimasukkan  ke dalam lemari es selama 5  menit. Setelah itu spesimen dipotong  dengan menggunakan alat yang bernama mikrotom. Mula-mula masukkan holder pada tempatnya lalu pasang pisau mikrotom kemudian kunci. Atur posisi specimen dengan tepat lalu kunci dan putar hingga specimen terpotong,  hasil potongan sebaiknya ditahan dengan menggunakan kuas namun jangan sampai terkena pisau sebab akan membuat pisau menjadi tumpul setelah itu ambil potongan spesimen dan letakkan pada kaca objek yang telah diberi label, diolesi dengan albumin yang berfungsi sebagai perekat, dan diolesi dengan aquades yang berguna untuk mempercepat proses penguapan. Setelah itu letakkan pada hotplate selama 24 jam.

                Langkah selanjutnya adalah pewarnaan. Spesimen dari hotplate diambil dan dideparafinasi dengan larutan Xylol I dan Xylol II masing-masing selama 15 menit tujuannya yaitu untuk menghilangkan parafin yang ada pada spesimen. Kemudian di rehidrasi dengan alcohol bertingkat mulai dari 100%, 95%, 80% dan 70% yang masing-masing dilakukan 5 kali pencelupan, namun sebelumnya kaca preparat di seka dengan tissue agar konsentrasi alcohol tidak berubah. Setelah itu dicelupkan pada pewarna hematoksilin yang berguna untuk mewarnai inti sel, setelah itu celupkan pada air kran menggunakan wadah agar specimen tidak hilang. Lakukan pewarnaan dengan pewarna eosin yang berguna untuk mewarnai sitoplasma selama 10  menit, cuci kembali dengan air kran dan keringkan dengan tissue. Lakukan kembali dehidrasi dengan alcohol bertingkat mulai dari 30%, 50%, 70%, 80%, 95% dan 100%, seka dengan tissue lalu masukkan ke  dalam larutan Xylol II dan Xylol I masing-masing selama 5 menit, larutan Xylol berguna untuk menjernihkan. Setelah itu beri entelan di tengah-tengah spesimen sebanyak 1-2 tetes yang berguna untuk merekatkan lalu tutup dengan kaca objek dan amati di bawah mikroskop.

    Struktur jaringan yang diamati pada praktikum ini, yaitu adrenalin mencit dan limpa mencit. Limpa merupakan kelenjar tanpa saluran yang berhubungan erat dengan sistem sirkulasi (Anonimus, 2005). Limpa mempunyai dua fungsi yaitu membentuk respon imun melawan antigen yang berada di dalam darah dan membuang bahan partikel dan sel darah yang sudah tua atau rusak, terutama eritrosit dari sirkulasi (Burkitt dkk., 1993).

    Ukuran dan berat limpa normal tergantung pada kandungan darah di dalamnya. Limpa salah satu organ limfoid terbesar, menerima suplai darah dalam jumlah banyak melalui arteri dan mengalami drainase melalui vena lienalis, yang berlanjut ke dalam sistem portal hati (Burkitt dkk., 1993). Struktur limpa mencitdibungkus oleh kapsula yang terdiri atas jaringan ikat padat yang terkadang membentuk trabekula untuk membagi parenkim atau pulpa limpa menjadi ruang-ruang bersekat, pada permukaan medial limpa terdapat hillus (Junqueira dan Carneiro, 1982).

Sistem sirkulasi darah pada limpa memiliki implikasi fungsional penting, terutama dengan memperlihatkan rangsangan antigen dan ekstraksi hemoglobin serta zat besi (Hartono, 1989). Limpa menghasilkan limfosit B dan T, serta makrofag yang sangat penting dalam pertahanan tubuh. Limfosit T yang ditemukan dalam pulpa putih berpoliferasi dan masuk ke aliran darah. Limfosit T berperan dalam mekanisme kekebalan yang diperantarai sel (Binns, 1982).

Simpulan

Pembuatan sediaan sayatan organ hewan dengan metode parafin melalui beberapa tahapan, diantaranya adalah fiksasi, pencucian, dehidrasi, penjernihan, infiltrasi, embedding, pengirisan, penempelan, pewarnaan dan penutupan. Dalam pembuatannya menggunakan parafin sebagai media embedding dikarenakan hasil pemotongan yang lebih tipis dibanding media dan metode lain.

DaftarPustaka

Anonimus.(2005). Sistem Limfatik (Lymphatic System). Diktat Ajar Histologi dan Embriologi Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Syiah Kuala. Darussalam, Banda Aceh.

Arisworo D dan Yusa. 2000. General Zoologi. Jakarta: PT. Grafindo Media Pratama.Binns, R. M. (1982). Organization of the Lymphoreticular System and Lymphocyte Markers in the Pig. Vet ImmunelImmunopathol, 3 – 95.

Gunarso W. 1986. Pengaruh Dua Jenis Cairan Fiksatif  yang Berbeda pada Pembuatan Preparat dari Jaringan Hewan Dalam Metoda Mikroteknik Parafin. Bogor: IPB Press

Burkitt, H.G., B. Young danJ.W.Heath. (1993). HistologiFungsional.Edisi 3.Diterjemahkanoleh Jan Tambajong.PenerbitBukuKedokteran, Jakarta.

Byuti B. (2004). BilaNyamukMenjadiTerdakwa. Info Vet.Edisi.1, 2, 3, Jakarta.

Dasumiati. 2008. Diktat Kuliah Mikroteknik. Prodi Biologi Fakultas Sains dan Teknologi UIN Syarif Hidayatullah. Jakarta : UIN Syarif Hidayatullah Press